A Imunofluorescência é uma técnica de imunomarcação , que utiliza tanto anticorpos quanto fluorocromos . A imunofluorescência permite revelar uma proteína específica diretamente na célula, por emissão de fluorescência . Assim, é possível determinar não só a presença ou ausência de uma proteína, mas também sua localização na célula ou no tecido analisado.
O fenômeno de fluorescência foi descoberto em meados do XIX ° século pelos Inglês cientista Sir George Gabriel Stokes . Ele foi o primeiro a observar que a fluorita , um mineral , fica fluorescente quando exposta aos raios ultravioleta , e deu a isso o nome de "fluorescência".
O primeiro trabalho com imunofluorescência data da década de 1950, quando os anticorpos foram conjugados a fluorocromos de natureza química, como a fluoresceína .
As primeiras proteínas fluorescentes (semelhantes aos fluorocromos usados na imunofluorescência) foram descobertas muito mais tarde, com a GFP ( Green Fluorescent Protein ), na década de 1960, por Osamu Shimomura e Roger Y. Tsien . Derivado de uma água-viva ( Aequorea victoria ), a descoberta dessa proteína rendeu-lhes o Prêmio Nobel de Química em 2008. Hoje, muitos fluorocromos usados em imunofluorescência são derivados da GFP.
Existem dois tipos de fluorescência. Em primeiro lugar, a chamada fluorescência “natural”, ou autofluorescência, emitida espontaneamente pela célula. Pode ser feita menção, por exemplo, à clorofila das células vegetais. Depois, há a fluorescência conferida por um fluorocromo, uma substância química que emite luz se for excitada em um determinado comprimento de onda.
Na imunofluorescência, podem ser realizados dois tipos de marcação. O primeiro é a imunofluorescência direta. Durante esta marcação, um anticorpo dirigido contra a molécula desejada, chamado antígeno, é usado. Este anticorpo é acoplado a um fluorocromo. Então, para revelar a preparação, pode-se usar um microscópio de epifluorescência ou um microscópio confocal. Essa técnica continua sendo uma das mais utilizadas na pesquisa científica.
A imunofluorescência indireta (IFI) é baseada no uso sucessivo de 2 anticorpos: o primeiro anticorpo do tipo monoclonal reconhece especificamente a proteína de interesse. O segundo anticorpo do tipo policlonal é direcionado contra o anticorpo primário (o primeiro).
Esta é a segunda marcação. Nesse caso, temos dois anticorpos. O anticorpo primário é dirigido contra o antígeno desejado. Em seguida, um segundo anticorpo é usado, marcado com um fluorocromo e tendo uma alta afinidade para o anticorpo primário (direcionado contra o isotipo do anticorpo primário, é então uma antiglobulina ).
Como vantagens, tem-se a possibilidade de realização de múltiplas rotulagens na mesma amostra de células, a rapidez e facilidade de uso desse método e também sua boa confiabilidade. Além disso, na imunofluorescência indireta, há um aumento da intensidade da luz, pois existem vários sítios de ligação nos anticorpos primários, o que possibilita a fixação de vários anticorpos secundários.
Mas existem algumas desvantagens. Por exemplo, a possibilidade de reações de falso positivo ou falso negativo, a apreciação subjetiva do grau de fluorescência e o fenômeno do foto-branqueamento. Para superar essas desvantagens, existem várias técnicas. Em primeiro lugar, realizar um controle negativo para imunofluorescência indireta, ou seja, colocar apenas os anticorpos secundários (marcados) em contato com a amostra a ser analisada. Após uma etapa de lavagem, se o controle negativo for bom, não deve ter emitido fluorescência, pois os anticorpos secundários não conseguiram se ligar e, portanto, saíram após a etapa de lavagem. Assim, o uso de câmeras de alta resolução e alta sensibilidade atenua o fotodegradação e permite um estudo quantitativo da aquisição.
Embora o princípio da imunofluorescência seja simples, muitos fatores devem ser levados em consideração na prática.
Podemos distinguir três áreas:
A imunofluorescência é usada em células em cultura (falaremos então de imunocitoquímica ) ou em seções de tecidos ( imunohistoquímica ).