Espectrofotômetro

Um espectrofotômetro é um instrumento para realizar uma medição espectrofotométrica . Um espectrômetro , ou espectroscópio , é um dispositivo que permite realizar uma medição espectrométrica da absorbância de uma solução em um determinado comprimento de onda ou sobre uma determinada região do espectro .

Princípio

De acordo com a lei de Beer-Lambert , a absorbância de uma solução é proporcional à concentração de substâncias em solução, desde que esteja no comprimento de onda em que a substância absorve os raios de luz. É por isso que o comprimento de onda é ajustado de acordo com a substância cuja concentração queremos saber.

• De acordo com a lei de Beer-Lambert, a absorbância é função da concentração C da solução, do coeficiente de absorção molar e do comprimento da solução para passar por L.NOλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

NOλ=-registro10⁡eueu0=ελ⋅ℓ⋅VS{\ displaystyle A _ {\ lambda} = - \ log _ {10} {\ frac {I} {I_ {0}}} = \ varepsilon _ {\ lambda} \ cdot \ ell \ cdot C}onde está a transmitância da solução.eueu0{\ displaystyle {\ frac {I} {I_ {0}}}}

• Observe que e são uma função do comprimento de onda de trabalho, ele é escolhido como uma função dos espectros de absorbância.NOλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

Aqui, os dois espectros são sobrepostos, para alcançá-los independentemente, medimos a absorbância de uma solução de NAD + (respectivamente de NADH, H + ) em diferentes comprimentos de onda (todas as outras coisas sendo iguais).

O comprimento de onda de absorbância máximo aqui é max = 260  nm para as duas moléculas. Portanto, será preferível trabalhar neste comprimento de onda. Por outro lado, se quisermos testar NADH, H + durante uma reação enzimática em que NAD + é reduzido a NADH, H + por exemplo, é mais judicioso trabalhar a = 340  nm porque aqui medimos apenas NADH, H + porque a absorbância do NAD + é zero mesmo se estiver presente na mistura. λ{\ displaystyle \ lambda}λ{\ displaystyle \ lambda}

Os espectrômetros de infravermelho (IR) são usados ​​principalmente para identificação. Pode-se dizer que, na prática, os espectrômetros de UV-visível são usados ​​para análises quantitativas, enquanto os espectrômetros de IV são instrumentos qualitativos. Ambos usam princípios ópticos semelhantes, mas a frequência do espectrômetro de IV varre a amostra.

Galeria:

• Espectrômetro de laboratório (tampa aberta).

• Espectrômetro de laboratório (fechado).

• Outro modelo.

• Espectrômetro portátil para medir a cor (geralmente expressa no sistema L * a * b * ) de uma superfície.

O espectrômetro UV-visível (UV: ultravioleta) inclui:

• uma fonte ou fontes de luz  : luz branca para medição no espectro visível ( luz policromática ) e / ou luz UV.
  • A lâmpada UV é geralmente do tipo deutério (faixa de 195 a 380  nm , vida útil da lâmpada de 1000  h , por exemplo).
  • A lâmpada visível é geralmente do tipo halógeno (faixa de 320 a 1000  nm , vida útil de 500  h , por exemplo).
  • Existem também espectrômetros de lâmpada de xenônio; (faixa de 190 a 1.100  nm )
• um monocromador formado por uma rede difratando a luz da fonte. Permite selecionar o comprimento de onda da luz que passará pela solução a ser dosada;
• um slot de largura fixa ou variável para ajustar a largura de banda;
• um porta-cubetas que permite que a solução a ser analisada seja mantida na temperatura desejada, essa temperatura é mantida por um circuito de água ou efeito Peltier . Esta manutenção em uma temperatura fixa é muito útil em medições de cinética enzimática , de fato, a taxa de reação depende da temperatura;
• uma cubeta transparente na qual a solução a ser estudada é colocada. Dependendo da qualidade e quantidade da amostra, existem diferentes cubetas, geralmente de plástico (espectro visível, perto de UV) ou de quartzo (UV, mas cubetas muito caras).

O solvente e o (s) reagente (s) utilizado (s) nem sempre são transparentes, sendo obrigatória a realização de um "branco" ou indicador de compensação, ou seja, zerar o dispositivo (tara), colocando apenas o solvente e o reagente ( s) utilizado na cubeta, antes da medição da cubeta contendo a amostra, para cada comprimento de onda estudado.
Os projetos de pesquisa são geralmente de feixe duplo e usam duas cubetas, a cubeta de referência contendo o solvente e o (s) reagente (s) e a cubeta contendo a amostra (com solvente e reagente (s)). O líquido na cubeta de referência é então automaticamente subtraído (função auto-zero);

• uma célula fotoelétrica , restaurando uma corrente proporcional ao número de fótons recebidos. Em modelos recentes, o detector do tipo fotodiodo único às vezes é substituído por uma matriz CCD ou uma matriz de diodo (cada célula sensível recebe uma cor fixa). Os modelos mais sensíveis usam um fotomultiplicador ou detector do tipo PMT;
• um detector eletrônico cuja resposta é proporcional a esta corrente elétrica e permite uma medição relativa da intensidade da luz.

A espectrometria é usada principalmente para determinar a concentração de uma solução de corante (um processo chamado ensaio colorimétrico ).

Áreas de aplicação

Em biologia

• O espectrômetro é usado ao realizar o teste MTT .
• Em biologia molecular , é usado durante a extração de DNA , para quantificar o DNA e determinar sua pureza. O comprimento de onda de 260  nm é usado, que é a área de absorbância máxima dos ácidos nucléicos. Uma segunda medição a 280  nm permite verificar a pureza da extração, nomeadamente a presença de proteínas residuais na solução de DNA.

Para uma solução de DNA purificada, a proporção R deve estar entre 1,8 e 2. Se R for significativamente menor que 1,8, então as proteínas provavelmente estão contaminando a solução. Maior que 2, esta proporção indica uma provável contaminação por RNA.

R = (A 260 - A 320 ) / (A 280 - A 320 ) R é simplificado quando (caso frequente) A 320 = 0.

A concentração de DNA pode ser calculada a partir da medição em 260  nm usando um fator de correlação:

• DNA de fita dupla: 1 Abs = 50 ng / µl
• DNA de fita simples: 33 ng / µl (como RNA de fita simples)
• RNA: 1 Abs = 40 ng / µl.

Em bioquímica , é utilizado durante a purificação de proteínas, para quantificá-las (comprimento de onda 280  nm ) e determinar seu nível de pureza (comprimento de onda 260  nm ).

Em medicina

Análise cinética de diferentes enzimas sanguíneas, determinação de fosfatase alcalina: colestase, lactato desidrogenase: enfarte do miocárdio, hemólise.

Na física

A análise da luz permite determinar os componentes químicos na origem da emissão de luz: por exemplo, a composição química das estrelas.

Em quimica

A análise da absorção de soluções em um determinado comprimento de onda permite a dosagem dessas soluções de acordo com a lei de Beer-Lambert (a concentração é proporcional ao logaritmo da absorção de luz). Portanto, há uma relação direta entre a quantidade de luz absorvida e a concentração do composto químico na solução. Monitorar a absorção ao longo do tempo é um método de caracterizar a taxa de reações químicas (cinética).

Uma varredura de frequência torna possível caracterizar as espécies presentes em solução, voltando à natureza da transição de energia considerada.

Nas artes gráficas

É usado para medir cores a fim de calibrar dispositivos de saída, como plotadoras .

Bibliografia

• Georges Bruhat , Optique , sexta edição, coleção de cursos de referência, Dunod, 2005, 1152 p.

Veja também

• Espectrofotometria
• espectrometria

Notas e referências

1. Cf. G. Bruhat (2005), Optics , sexta edição, Dunod: § Spectrophotometry.
2. Pela homogeneidade com a unidade geralmente usada para o coeficiente de absorção molar, o comprimento é expresso em cm. É por isso que a maioria das cubetas é padronizada em L = 1  cm .