A microscopia de fluorescência (ou epifluorescência ) é uma técnica que utiliza um microscópio óptico que aproveita o fenômeno da fluorescência e da fosforescência ao invés de, ou em adição à observação convencional por reflexão ou absorção de luz visível natural ou artificial.
Podemos assim observar vários objetos, substâncias (orgânicas ou inorgânicas) ou amostras de organismos vivos ou mortos.
Agora faz parte dos métodos clássicos de pesquisa e biologia e continua a se desenvolver com imagens moleculares .
A fluorescência é a propriedade que certos corpos possuem de emitir luz após absorver fótons de maior energia. A microscopia de fluorescência é baseada na formação de uma imagem pela detecção dessa luz emitida. O deslocamento de Stokes descreve a diferença entre o comprimento de onda absorvido pelo comprimento do objeto (emitido pela fonte de luz do microscópio) e emitido pelo objeto. Quanto maior a diferença entre os dois comprimentos de onda, mais fácil é observar a fluorescência.
Na fluorescência, dois tipos de objetos são distinguidos:
Na microscopia de fluorescência, portanto, é possível visualizar diretamente as substâncias fluorescentes. Para substâncias não fluorescentes, células, moléculas, é necessário marcá-las com substâncias chamadas fluorocromos, como o DAPI que marca o DNA e fica fluorescente em azul.
Certos marcadores genéticos, como a proteína fluorescente verde (em inglês Green Fluorescent Protein ou GFP), também são amplamente usados em biologia em organismos geneticamente modificados para produzi-los endogenamente . Nesse caso, o fluorocromo é uma proteína produzida diretamente pela própria célula e não requer a adição de substrato. A fluorescência pode então ser visualizada diretamente em células vivas, este é um dos campos desenvolvidos pela imagem molecular .
Muitas técnicas de marcação podem ser usadas:
As substâncias fluorescentes podem ser excitadas por excitação de um único fóton. Uma luz de excitação é usada para isso, cujo comprimento de onda excita diretamente o fluoróforo. Portanto, a fluorescência emitida pode vir de toda a espessura da amostra atravessada pelo feixe de excitação. O elemento chave deste microscópio confocal é então representado por uma "janela" (um orifício ou íris confocal) colocada na frente do detector que elimina a fluorescência das regiões não focais. A observação de sinais de fluorescência é baseada em cinco elementos:
Essa excitação consiste na absorção quase simultânea de vários fótons de excitação de um comprimento de onda próximo a um múltiplo da excitação ótima em um fóton. Para isso, um laser pulsado é utilizado em frequências próximas ao infravermelho. Nesse caso, apenas o ponto focal do feixe de laser é um excitador (densidade de fótons suficiente para acoplar a energia de excitação). Freqüentemente, as aplicações são limitadas à microscopia de dois fótons (excitação do fluoróforo por dois fótons).
Este sistema é considerado um importante desenvolvimento tecnológico por três razões principais:
Na prática, a eficiência de emissão de fluorescência é menos boa do que um único fóton confocal e a relação sinal / ruído é menor. Assim, apresenta pouca vantagem para a observação de células em cultura ou cortes de tecido (50-70 µm de espessura).
Esta técnica é naturalmente usada para a excitação simultânea de vários fluoróforos com diferentes espectros de emissão.
Uma variante dessa técnica é a microscopia de fluorescência por excitação multifotônica multifocal . O princípio é idêntico, mas o feixe de laser é dividido em vários feixes, o que possibilita a varredura de vários pontos simultaneamente. Isso permite reduzir o tempo de aquisição das imagens.
As técnicas de fluorescência podem ser usadas com diferentes tipos de microscópio:
Esses dispositivos possuem peças intercambiáveis em forma de cubo dispostas em uma torre giratória ou em uma aba de puxar, dependendo do fabricante.
Esses “cubos” filtram a luz que vai em direção à objetiva e vai em direção ao observador ou ao sensor, de acordo com as fluorescências buscadas.
Incluem 2 filtros e um espelho particular, "dicróico" que reflete certos comprimentos de onda e que é atravessado por outros.
Em direção à fonte está o filtro de excitação.
No lado do observador está o filtro de barreira.
Os cubos são listados de acordo com as luzes de excitação: ultravioleta, roxo, azul, verde ...
Esta técnica é usada, em particular, para observar monocamadas lipídicas às quais foi adicionada uma sonda lipídica fluorescente. A fluorescência é observada dependendo da fase em que o lipídio principal está localizado. Em geral, a sonda é solúvel na fase líquida expandida (LE), mas não nas fases gasosa (G) ou sólida (S). Isso permite observar as macroestruturas formadas pela monocamada. Ao lado, uma monocamada lipídica em equilíbrio é observada por microscopia de epifluorescência . A sonda lipídica fluorescente é solúvel na fase LE, mas não na fase G. O resultado é que observamos, em equilíbrio, tipos de bolhas (mas uma "bolha" é um conceito tridimensional) cujas paredes são constituídas. lipídio na fase LE e o interior na fase G. Se tomarmos um exemplo tridimensional, seria como pegar espuma de sabão e cortar uma fatia muito fina dela.
Imagem de epifluorescência de três componentes de uma célula cancerosa humana em divisão. O DNA aparece em azul, uma proteína chamada INCENP aparece em verde e os microtúbulos em vermelho. Cada fluoróforo foi fotografado separadamente, com um comprimento de onda de excitação e filtros específicos, em seguida, uma imagem foi recomposta, a partir das fotos tiradas pela câmera CCD .
Células endoteliais de uma artéria pulmonar bovina (núcleos corados em azul com DAPI, microtúbulos marcados em verde com um anticorpo ligado a FITC e filamentos de actina marcados em vermelho com faloidina ligada à proteína TRITC).
Núcleo de linfócitos humanos corado com DAPI com cromossomos 13 (verde) e 21 (vermelho) por sondas hibridizadas com centrômeros ( hibridização in situ em fluorescência ).
Membrana celular de levedura , demonstração da estrutura (em amarelo) obtida pela fusão de proteínas de membrana com dois marcadores fluorescentes (RFP e GFP).
Detecção da molécula YFP em uma célula de câncer humano, em escala nanométrica.
Núcleo de uma célula óssea cancerosa (técnica chamada microscopia de localização de duas cores ou 2CLM para falantes de inglês). Imagem obtida por fluorescência de marcadores fundidos com as proteínas GFP e RFP, para 120.000 moléculas localizadas em área restrita (470 µm 2 ).