Ágar Toluidina DNA-Azul
O Toluidine Blue DNA Agar é usado para determinar a presença de atividade de nuclease em um microrganismo.
Rotineiramente, é usado para identificar a expressão de uma DNAse resistente ao calor (ou TNase termonuclease) característica das espécies de Staphylococcus aureus .
Usar
Pesquisa da DNAse resistente ao calor de Staphylococcus ( Microbiologia alimentar e médica)
Princípio
- Em primeiro lugar, a eliminação de nucleases termolábeis por aquecimento (em particular de Staphylococcus epidermidis e Micrococcus sp. )
- Metacromasia do azul de toluidina para vermelho / rosa devido à ação da TNase no DNA do meio (na presença de Ca ++ )
- A toluidina colore os nucleotídeos em rosa.
Composição
Composição baseada em Les Milieux de culture de N. Marchal, JL Bourdon e Cl. Richard
- Tampon TRIS pH 9 (0,05 M) .................................1000mL - ADN .......................................................0,3g - Solution de bleu de toluidine (0,1 M)......................3mL - Solution de chlorure de calcium (CaCl2) (0,01 M) ..........1mL - chlorure de sodium (NaCl)..................................10g - Agar-agar..................................................10g( pH final = 8,6)
Preparação
Meio pronto para usar. É possível fabricá-lo a partir dos constituintes básicos.
Pesquise DNAse termoestável ou Thermonuclease
A DNAse termoestável é uma enzima que resiste ao calor (100 ° C por 15 minutos) e que degrada o DNA de acordo com a reação:
Técnico
Inocular o caldo cérebro-coração por 24 horas a 37 ° C, ou 3 a 4 horas com agitação, com a cepa a ser estudada.
Coloque parte dela por 15 minutos em banho-maria (100 ° C) e guarde o resto.
Perfure a placa de ágar com 3 orifícios. Inocular algumas gotas:
- Caldo estéril no primeiro poço. (controle negativo)
- Caldo aquecido e resfriado, no segundo poço.
- Caldo não aquecido no terceiro. (opcional - controle positivo)
Incubar 4 horas a 37 ° C.
Notas: Observe o conteúdo de cada poço na parte traseira da placa de Petri. Limite a algumas gotas de caldo sem transbordar os poços. Incube o ágar sem inverter o prato.
Leitura
A observação de um possível halo rosa de metacromasia indica a presença de DNAse ao redor dos orifícios perfurados no fundo azul do ágar.
- Controle bem: contendo caldo cérebro-coração estéril
- Poços contendo meio do núcleo do cérebro com a cepa a ser estudada
- Bem contendo meio cérebro-coração semeado e, em seguida, aquecido a 100 ° C por 10 minutos
- Se o poço 1 ficar rosa, o teste deve ser reiniciado.
- Se o poço 2 ficar rosa e o poço 3 permanecer azul, a cepa tem uma DNase não termoestável.
- Se os poços 2 e 3 são rosa, a cepa tem uma DNase termoestável (portanto, S. aureus se Hull Gram-positivo )
Limites
- Presença de TNase em S. hyicus , S. intermedius , S.lugdunensis e S. schleiferi
Alternativa simplificada
Outro método proposto por Diagnostics Pasteur também pode ser utilizado. Aqui está o que consiste em:
- No Baird-Paker , após 24 horas de cultura (geralmente 48 horas )
- Observe os pratos para colônias suspeitas (colônias pretas com halo claro)
- Coloque essas caixas a 60 ° C por 2 horas e deixe esfriar
- Cubra o meio Baird-Paker com meio DNA-Toluidina super - resfriado (~ 45 ° C ) e deixe solidificar.
- Incubar a 37 ° C por 3 a 4 horas
- Observe o resultado
As zonas de halos rosa são, aqui também, características de uma termonuclease presente nas bactérias das colônias suspeitas.
Veja também
Referências
- N. Marchal, JL Bourdon, Cl Richard. , Les milieux de cultura: para o isolamento e identificação bioquímica de bactérias , Fazendo,1987, p. 185; 192-193