Microbiologia

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Subclasse de Biologia , ciências exatas
Praticado por Microbiologista
Campos Bacteriologia,
virologia,
protistologia

A microbiologia é um campo da ciência aplicada que visa os microrganismos e as atividades que os caracterizam. Mais especificamente, a microbiologia se dedica à identificação e caracterização de microrganismos; ao estudo de sua origem e evolução; definir suas características, os produtos de suas atividades e suas necessidades; e entender as relações que mantêm entre si e com seu ambiente natural ou artificial.

Microrganismos pertencentes a três reinos que exibem uma estrutura celular eucariótica ou procariótica, ou que é eucariótica, e que se caracteriza pela unicelularidade, tamanho microscópico ou ultramicroscópico, potencial metabólico e reprodutivo, ubiqüidade e abundância. Os microrganismos são divididos em cinco grupos: algas , protozoários , fungos , bactérias , vírus e príons . As bactérias são classificadas entre os moners . As algas unicelulares são parte dos protistas procarióticos e eucarióticos . Fungos unicelulares, líquenes e protozoários são protistas eucarióticos. Os vírus e príons são acariotos (ou seja, sem organização celular).

Agora falamos também de "  microbiologia molecular  ", no campo da biotecnologia em particular.

Histórico

Desde a Antiguidade, postulava-se a existência de agentes infecciosos transmissíveis e invisíveis a olho nu.

Organismos estudados

Procariontes

Procariontes Prokaryota ou Prokarya), do grego pro (antes) e caryon (núcleo) , são organismos cuja célula não tem núcleo celular ou outras organelas, pertencem a pelo menos dois táxons distintos:

Esses microrganismos possuem mecanismos para resistir a essas condições.

Eucariotos

Os eucariotos têm um sistema de membrana interna envolvendo organelas ( núcleo , plastídio , mitocôndria ,  etc. ); eles têm um citoesqueleto interno (actina, tubulina) ausente nos procariotos, o que os torna frequentemente maiores do que os procariontes.

Acredita-se que cada grupo de eucariotos tinha um ancestral entre os procariotos (arqueobactérias ou eubactérias) e que as mitocôndrias (e possivelmente também outras organelas como os cloroplastos ) presentes no citoplasma dos eucariotos atuais também tinham pelo menos um ancestral procariótico distinto que teria colonizado essa antiga bactéria para viver em simbiose ( endossimbiose ) com ela e formar todos os eucariotos que não podem mais viver sem eles.

Na verdade, encontramos na mitocôndria um citoesqueleto interno específico, uma estrutura de membrana externa complexa, um material genético interno específico alojado em uma zona plasmática chamada proto-núcleo (desprovido de membrana, mas ainda estruturado), mesmo que a mitocôndria não possa se multiplicar. seus próprios sem a ajuda da célula hospedeira (as mitocôndrias teriam perdido suas faculdades reprodutivas que não eram mais necessárias para elas, uma vez que a célula hospedeira lhes fornece praticamente todo o material necessário para seu crescimento e divisão).

Algas

Ao contrário dos fungos e protozoários, as algas têm pigmentos de clorofila que permitem a fotossíntese.

Eles são, portanto, organismos vivos imóveis e autotróficos .

As algas estão presentes no solo, plantas, água doce e água do mar.

A palavra "alga" não faz sentido do ponto de vista filogenético, ou seja, o ancestral comum a todas as algas é o dos eucariotos.

Cogumelos

Os fungos estão presentes no solo, plantas, restos de plantas, líquenes , parasitas humanos, animais e plantas.

Nota  : Uma levedura , eucarioto unicelular, é um fungo. Existem muitas espécies de leveduras, como Saccharomyces cerevisiae (fermento de padeiro), a família Candida (responsável pela candidíase), Rhodotorula (às vezes encontrado em chucrute que fica vermelho), Schizosaccharomyces , etc.

Os fungos são “absorbotróficos”: eles se alimentam por absorção. Eles secretam enzimas que digerem polímeros no ambiente externo, esse mecanismo químico, por exemplo, transforma carboidratos em monômeros (pequenas moléculas) que são assim absorvidos.

Os fungos são um grupo bifilético, pois uma parte deles, os eumicetes, pertencem aos opistocontes e outra, os oomicetos, aos heterocontes.

Tamanho dos microorganismos

Como apontado no início, os microrganismos são muito pequenos (daí seu nome):

A relação área / volume é diretamente influenciada pelo tamanho: se considerarmos uma forma simples como a esfera , a área é proporcional ao quadrado do tamanho ( com o raio da esfera), enquanto o volume é proporcional ao cubo do tamanho ( ), a relação superfície / volume é, portanto, inversamente proporcional a ( ).

Isso condiciona a velocidade com que o microrganismo se alimenta: o alimento passa pela membrana plasmática, de modo que a velocidade de absorção é proporcional à superfície, mas a quantidade a ser fornecida é proporcional ao volume. A taxa de entrada e saída de nutrientes e resíduos é, portanto, inversamente proporcional ao tamanho. Portanto, quanto menor for a bactéria, mais ela será capaz de se alimentar em alta velocidade. Ele compensa seu pequeno tamanho multiplicando-se em uma velocidade muito alta (taxa de crescimento muito rápida).

Cultura de microorganismos

Riqueza do meio ambiente

Os microrganismos precisam de:

Diversidade do ambiente cultural

Existem dois tipos de meios de cultura:

e entre esses dois tipos de meios, há os seletivos (que permitirão selecionar o tipo de microrganismos que ali poderão se multiplicar). Assim, é possível escolher permitir que apenas um determinado tipo de bactéria se desenvolva (por exemplo, meio mFC para coliformes fecais ou ágar sangue para certos patógenos) ou, pelo contrário, promover o desenvolvimento de fungos por meio da adição de um antibiótico ao meio. A temperatura na qual o meio inoculado será incubado também constitui um fator de seleção, conforme mencionado acima.

Os meios de cultura podem conter extratos de levedura (células de levedura desidratadas e lisadas) que fornecem uma fonte de aminoácidos, vitaminas e nitrogênio, extratos de malte fornecem uma fonte de carbono, peptonas (proteínas animais, peixes, caseína do leite) fonte de nitrogênio orgânico de interesse para heterotróficos indivíduos.

Esses meios são líquidos ou sólidos. Para solidificar o meio é frequentemente utilizada ágar ou ágar-ágar , um polímero de açúcar derivado de uma alga vermelha tendo a propriedade de formar um gel com água sólido a temperaturas inferiores a 60  ° C .

Métodos

Teste de desafio

O teste de desafio é uma técnica que permite demonstrar a eficácia antimicrobiana ( bacteriostática ou bactericida ) de uma determinada substância (produtos farmacêuticos, cosméticos ou agroalimentares, por exemplo).

Esta técnica consiste em inocular uma quantidade conhecida de diferentes germes microbianos ( bactérias , leveduras , bolores ,  etc. ) na substância a ser testada e, em seguida, contar esses germes em vários momentos.

Este teste é usado em particular para validar a data de validade (DLC) ou a data de validade ideal (DLUO) de um produto.

Esterilização

A esterilização é o processo de remoção de microrganismos de um objeto e de forma sustentável. Em microbiologia, o objetivo da esterilização é, por um lado, controlar os microrganismos introduzidos no ambiente de estudo e, por outro lado, evitar a contaminação do ambiente externo e das pessoas (ver também o artigo sobre higiene ).

Existem três maneiras de esterilizar um meio de cultura. Destruição por calor, por um método de filtração ou pelo uso de radiação e agente químico (gás).

Aquecer

É feita uma distinção entre processos de calor “seco” e “úmido”.

Casos especiais: pasteurização e tipalização

A pasteurização é um processo de preservação de alimentos no qual um alimento é aquecido a uma temperatura definida por um período de tempo definido antes de ser resfriado rapidamente. Temperaturas de pasteurização variar entre 70  ° C e 85  ° C . Essa técnica destrói apenas parte da flora bacteriana. Não é de forma alguma uma técnica de esterilização .

A tyndalização é uma série de aquecimento breve a temperaturas de 70  ° C em intervalos regulares (três aquecedores hora vinte e quatro horas entre aquecimento) para permitir que as formas resistentes germinem para matá-las no próximo aquecimento. Por exemplo, a destruição de germes patogênicos no leite é feita por um ciclo de 63  ° C por trinta minutos seguido de 73  ° C por quinze minutos.

A fervura não é um método de esterilização. As formas de esporos de bactérias podem sobreviver até oito 30 horas a 100  ° C .

Filtração

A filtração é uma técnica que consiste em passar um líquido por um filtro cujos poros têm 0,2 mícrones de diâmetro   ; os microorganismos são muito grandes para passar e, portanto, são retidos pelo filtro. Para forçar este líquido através do filtro, duas soluções são usadas:

Esta técnica é interessante quando se utilizam produtos termolábeis (ou seja, produtos não resistentes ao calor), como certos aminoácidos aromáticos, vitaminas, hormônios de crescimento, ácidos nucléicos e grande parte dos antibióticos. No entanto, os filtros de 0,2  µm entopem rapidamente. Este problema pode ser contornado aumentando a área de superfície do filtro ou usando um processo de filtração tangencial .

Em certos casos, o filtro que serviu para bloquear os microrganismos pode ser colocado num meio de cultura sólido de forma a permitir a multiplicação dos germes, isto com o objetivo de proceder à sua enumeração e identificação.

Radiação e agente químico

Essas técnicas são usadas por indústrias, incluindo alimentos. Eles são muito penetrantes porque a radiação e alguns gases passam pelo plástico e matam os microorganismos.

Os raios ultravioleta não são uma boa técnica de esterilização, porém, por não serem penetrantes, não passam por materiais como plástico e vidro. Além disso, certos microrganismos são capazes de reparar os danos causados ​​pelos raios ultravioleta se o produto for iluminado após a aplicação dos raios ultravioleta; este é o fenômeno denominado “fotocorreção”.

Em certos casos , a radiação gama pode ser usada , que é muito mais penetrante e poderosa do que os raios ultravioleta.

Conceito de cultura pura

Técnica de streak

Baseia-se no conceito de UFC (unidade formadora de colônia). Cada unidade celular (uma célula, um grupo de células ou um pedaço de hifas ) dará origem a uma colônia.

No meio de cultura, ocorre a formação de um monte de bactérias ou leveduras com uma forma particular (a colônia). A forma desse monte é determinada pela organização da colônia, que por sua vez é determinada geneticamente. Os fungos desenvolverão um talo, ou seja, o que pode ser observado, por exemplo, em compotas que apresentam "mofo". UFC também é usado para enumeração bacteriana usando culturas de placas de tubos preparados por diluições em cascata da suspensão bacteriana original.

A observação macroscópica do aspecto das colônias permite diferenciar as colônias de bactérias contaminantes daquelas que se pretende isolar.

Técnica de suspensão de diluição

Esta técnica é usada para avaliar o número de microrganismos encontrados em um meio líquido (água de poço, bebidas, água de piscina,  etc. ) ou em um meio sólido (solo, comida,  etc. ). Também pode ser usado para isolar uma cepa pura de uma mistura.

É simplesmente uma série de diluições seguidas de uma amostra de uma alíquota que será espalhada em um meio de cultura que pode ou não ser seletivo. Será então suficiente contar o número de colônias e, sabendo o volume da alíquota (geralmente um mililitro por prato), deduziremos a quantidade aproximada de bactérias no meio (considera-se que uma UFC corresponde a uma bactéria) .

Identificação de bactérias

A identificação das bactérias é feita de acordo com uma chave dicotômica que vai dos caracteres maiores aos mais pontiagudos para terminar com uma determinada espécie bacteriana.

Critérios morfológicos

O estudo da morfologia bacteriana é o primeiro ato realizado por um laboratório de diagnóstico para identificar uma bactéria. A observação da morfologia bacteriana permite uma orientação preliminar do diagnóstico.

Macroscópico

A olho nu, podemos distinguir as características de uma colônia:

Existem três tipos principais de colônias:

Microscópico Estado fresco

O estado fresco será feito com uma suspensão de colônia que não será fixada na lâmina como a mancha de Gram, mas será feito com uma gota de suspensão entre a lâmina e a lamela. Esta observação microscópica será feita com a objetiva x40 com pouca luz para não matar as bactérias, pois o objetivo desta observação é ver a sua mobilidade (também podemos ver a morfologia mas isso é melhor visto na coloração de Gram).

Coloração de Gram

Sendo as bactérias geralmente quase transparentes, começamos por preparar um esfregaço (fazer um esfregaço) numa lâmina de microscópio, onde aplicamos uma coloração de Gram . A observação microscópica será feita com a objetiva x100 com óleo de imersão. As bactérias Gram-positivas aparecerão violetas, enquanto as bactérias Gram-negativas aparecerão em rosa. Existem outras colorações, como o verde malaquita para destacar as formas esporuladas. A coloração de Gram é usada para determinar o tipo de parede celular.

Forma

A forma é extremamente diversa no mundo bacteriano. Com exceção das bactérias sem parede ( Mycoplasmas ), que podem ser muito polimórficas, a diversidade é relativamente limitada para bactérias de interesse médico e veterinário. Entre estes, distinguimos principalmente as formas esféricas ( cocos ), cilíndricas ( bacilos ), espirais ( espirila ), enroladas (espiroquetas) com apêndices em brotamento ou filamentosos.

Modo de agrupamento

Eles podem se agrupar em cadeias ( Streptococcus , Enterococcus , Lactococcus ,  etc. ), em aglomerados ou aglomerados assimétricos ( Staphylococcus ), em aglomerados cúbicos regulares (sarcinos), em paliçadas ou em feixes de alfinetes ( Corynebacterium ),  etc. O modo de agrupamento, desde que seja avaliado numa cultura jovem realizada em meio líquido e que seja levado em consideração o aspecto predominante, é também um elemento importante para orientar a identificação.

Cortar

As menores bactérias têm 0,1 a 0,2 µm de  tamanho ( Chlamydia ), enquanto algumas têm diâmetro maior que 10  µm . A maior bactéria conhecida ( Thiomargarita namibiensis ) pode atingir um diâmetro de 750  µm .

Presença de esporos

Nem todas as bactérias têm a capacidade de esporular. Todos os bacilos Gram + esporulam sob estresse. Para mostrar os esporos em um microscópio óptico, você apenas tem que tingi-los com verde malaquita ou tinta nanquim. Mas podemos adivinhá-los com a coloração de Gram (ausência de coloração). Os esporos estão presentes em Bacilli.

Mobilidade

As bactérias podem ser equipadas com um ou mais flagelos, permitindo que se movam. Os dois tipos mais comuns de mobilidade são mobilidade por ciliação peritoneal, se a bactéria se mover em todas as direções, ou por ciliação polar, se a bactéria seguir apenas em uma direção. Para definir o modo de movimento das bactérias, falamos de quimiotaxia. A bactéria que evolui em um meio se move de acordo com gradientes de concentração para se aproximar de seu "alimento"

Certa motilidade depende de um mecanismo envolvendo pilus tipo IV e vários polissacarídeos como na bactéria Myxococcus xanthus .

Cápsula

A cápsula é formada por polímeros (polissacarídeos ou proteínas) dispostos em camadas na periferia da bactéria. Isso permite que a bactéria adira a superfícies (colonize superfícies) e escape do sistema imunológico porque os antígenos de superfície são cobertos pela cápsula, o que os torna indetectáveis ​​(patogenicidade).

Critérios bioquímicos

Uma bactéria também é identificada ao observar se ela usa um substrato específico. É, portanto, colocado em contato em um meio de cultura com um carboidrato, ou um peptídeo, ou outros substratos mais complexos - o teste da oxidase, por exemplo, usa tetrametil-parafenilenodiamina . O uso deste substrato pode ser revelado alterando um indicador de pH porque um carboidrato usado fornece um produto ácido, um peptídeo fornece um produto básico, etc.

Cada família de bactérias possui características próprias, portanto podemos facilmente agrupá-las com características básicas como o uso de glicose com ou sem oxigênio, redução de nitratos, etc. Depois, temos galerias de identificação bioquímica que às vezes são vendidas por empresas especializadas. Esses testes são bastante longos, de um a dois dias.

Critérios genéticos

Podemos citar técnicas de engenharia genética como:

  • a PCR ( Reação em Cadeia da Polimerase ) para direcionar um gene presente apenas em uma família ou gênero bacteriano por reanexação de sequências curtas de DNA específicas (oligonucleotídeos iniciadores) sintético específico;
  • o microarray usando o mesmo princípio, mas com uma precisão de até a mesma deformação.

Sistemática bacteriana

A sistemática permite identificar uma cepa bacteriana desconhecida graças a vários exames e ao uso de meios de cultura específicos.

A coloração de Gram e teste da catalase e da oxidase para determinar a família. Ambientes de cultura específicos permitem chegar ao gênero e à espécie. Testes adicionais, como sorogrouping, podem ser usados ​​em alguns casos.

Cocos Gram positivos e catalase positivos Shell Gram positivo e catalase negativo Concha Gram negativa

O Gram negativo consiste em bactérias de paredes finas que não retêm o azul de genciana / cristal. Eles aparecem em um microscópio de luz em rosa após a adição de fucsina (gênero neisseria, por exemplo).

Bacilo Gram positivo Bacilo Gram negativo Oxidase negativa

Família de Enterobacteriaceae  :

Oxidase positiva

Agentes antibacterianos

Agentes físicos

Os seguintes agentes podem ser mencionados:

  • calor: a partir de 65  ° C , as proteínas são desnaturadas, porém alguns microrganismos são capazes de suportar temperaturas mais elevadas;
  • o pH  : se é muito ácido ou muito básico;
  • altas pressões: a partir de 6.000  bar. Assim, é com tratamento por pressão que os sucos de frutas produzidos na indústria são esterilizados ;
  • Raios UV: em um comprimento de onda de cerca de 260  nm , eles destroem todos os microorganismos. Não são muito eficazes com os plásticos, são usados ​​para esterilizar o ar;
  • raios gama: como os raios ultravioleta, são muito eficazes. Eles podem passar por todos os plásticos e, portanto, são usados ​​para esterilizar instrumentos, como fios cirúrgicos. Seu uso tem sido tentado para produtos alimentícios, sem sucesso com o público.

Agentes químicos

Os agentes químicos usados ​​se enquadram em duas categorias: anti - sépticos e desinfetantes . Os anti-sépticos são usados ​​para a remoção de microorganismos do tecido vivo; desinfetantes são usados ​​em superfícies inertes.

Antibióticos

Os antibióticos são produtos químicos que possuem uma ação específica com o poder de limitar a proliferação de bactérias específicas. Eles são desprovidos de toxicidade para outras células (fungos e outros eucariotos). Essas moléculas podem ter uma ação drástica, ou seja, bactericida; sua eficácia também pode ser limitada na prevenção do desenvolvimento de bactérias (isso é conhecido como ação bacteriostática).

Resistência a antibióticos

Crescimento bacteriano

É o poder ou capacidade das bactérias de aumentar seu número; depende do tipo de bactéria (termófilos, mesófilos, psicrófilos, psicrotróficos, etc.). Quando as bactérias são incubadas em um meio líquido adequado, geralmente continuam a se multiplicar exponencialmente até que um fator necessário ao seu crescimento se aproxime da exaustão e se torne limitante ou inibitório produtos metabólicos (ácidos orgânicos, álcoois, amônia, etc.) acumulam-se excessivamente. Esta cultura, realizada sem adição de nutrientes ou remoção de resíduos durante o crescimento, é chamada de cultura em batelada ou batelada que constitui um sistema fechado. Uma cultura desse tipo se comporta como um organismo multicelular com limitação de crescimento determinada geneticamente.

O crescimento de tal cultura pode ser representado graficamente traçando o logaritmo do número de células viáveis ​​em função do tempo. A curva obtida pode ser dividida em seis fases:

  1. Fase de latência. É um período de adaptação da linhagem ao seu novo ambiente. Esta fase seria inexistente se a cepa fosse derivada do mesmo meio de cultura;
  2. Fase de aceleração. Durante esta fase, ocorre a síntese ativa de enzimas;
  3. Fase de crescimento exponencial. Durante esta fase, a bactéria cresce a uma taxa constante máxima;
  4. Fase de desaceleração. Nessa fase, o meio começa a se esgotar: diminuição da concentração de nutrientes, os resíduos celulares começam a se acumular no meio;
  5. Fase estacionária. Durante essa fase, há tantas bactérias que se dividem quanto bactérias que morrem;
  6. Fase de declínio. Durante esta fase, a bactéria morre devido à falta de nutrientes e ao excesso de resíduos que a bactéria produz.

Diauxie

Na presença de duas fontes de carbono, as bactérias apresentam uma curva de crescimento de duas fases. Isso é explicado pelo consumo da fonte de carbono mais facilmente assimilada, em seguida, uma adaptação durante a qual as enzimas que permitem degradar a segunda fonte de carbono são sintetizadas e, em seguida, o consumo da segunda fonte de carbono (é o caso, por exemplo, do meio Kligler-Hajna Nesse meio, a bactéria usa a glicose como a primeira fonte de carbono e depois a lactose como a segunda fonte de carbono quando não há mais glicose). A análise desse comportamento permitiu a Jacques Monod definir a noção de operon  ; o mais conhecido é o operon da lactose.

Notas e referências

  1. Le Grand Dictionnaire terminologique , “microorganisme” .
  2. acesso a um documento de resumo divulgado pela ADIT (artigo P r D r  Axel A. Brakhage, "Themaceutical bioproducts", p.  11/29 , in "White biotechnology, advance and perspectives - Meeting of Experts Franco German", Berlin, 29 de setembro de 2006).
  3. Bonazzi, Florence (2005), Higiene no consultório médico de clínica geral: observação de 30 médicos da área de Grenoble (dissertação de doutorado, Joseph-Fourier University).
  4. (em) Salim T. Islam , Israel Vergara Alvarez , Fares Saidi e Annick Guiseppi , "  Modulation of bacterial multicellularity via spatio-specific polysaccharide secretion  " , PLoS Biology , vol.  18, n o  6,9 de junho de 2020, e3000728 ( ISSN  1545-7885 , PMID  32516311 , PMCID  PMC7310880 , DOI  10.1371 / journal.pbio.3000728 , ler online , acessado em 14 de dezembro de 2020 )

Veja também

Artigos relacionados

Link externo