Em biologia molecular , um morfolino é um tipo de molécula usada para alterar a expressão gênica . A tecnologia de oligonucleotídeo de morfolino é uma tecnologia antisense usada para bloquear o acesso de outras moléculas a sequências específicas de certas moléculas de ácido nucleico . Eles podem bloquear o acesso de outras moléculas a pequenas regiões (cerca de 25 bases) da superfície de emparelhamento de bases de ácidos ribonucleicos (RNA). Os morfolinos são às vezes chamados de PMO , uma sigla em inglês que significa fosforodiamidato morfolino oligo . A palavra "morfolino" pode aparecer em outros nomes químicos. Relaciona-se a produtos químicos que contêm um anel de morfolina de seis subunidades; este artigo discute apenas oligonucleotídeos antisense de morfolino.
Na pesquisa biológica, os morfolinos são geralmente usados como ferramentas para a genética reversa , inativando a função de um gene. Isso é realizado evitando que as células sintetizem uma proteína- alvo ou alterando o splicing de um pré-mRNA . A desativação da expressão gênica é um método poderoso para estudar a função de uma proteína específica. Da mesma forma, induzir o splicing de um exon específico pode ajudar a determinar a função da parte da proteína codificada por esse exon. Essas moléculas foram aplicadas ao estudo de vários organismos modelo, incluindo ratos , peixe - zebra e xenopus .
Os morfolinos também estão sendo desenvolvidos como terapia farmacêutica dirigida contra organismos patogênicos , como bactérias ou vírus, e para o aprimoramento de terapias contra doenças genéticas . Esses oligonucleotídeos sintéticos foram projetados pelo Dr. James E. Summerton ( Gene Tools , LLC) e desenvolvidos em colaboração com o Dr. Dwight D. Weller ( AVI BioPharma Inc. ).
Morfolinos são moléculas sintéticas que resultam de um rearranjo da estrutura natural dos ácidos nucléicos. Normalmente com 25 bases de comprimento, eles se ligam a sequências de RNA complementares por emparelhamento de bases . Estruturalmente, embora os morfolinos tenham bases de nitrogênio clássicas, eles diferem do DNA porque essas bases de nitrogênio estão ligadas a anéis de morfolina em vez de desoxirribose . Esses anéis de morfolina são ligados entre si por grupos fosforodiamidato em vez de grupos fosfato . É mais fácil visualizar isso consultando a Figura 1 e comparando as estruturas de uma fita de RNA e uma fita de morfolino. Substituir os grupos de fosfato aniônico por grupos de fosforodiamidato sem carga elimina a ionização na faixa de pH fisiológica usual, de modo que os morfolinos em organismos ou células são moléculas sem carga. Toda a espinha dorsal de um morfolino é composta por essas subunidades modificadas. Os morfolinos são mais comumente usados como oligonucleotídeos de fita simples, portanto, heteroduplexes formados a partir de uma fita de morfolino e DNA complementar podem ser usados em combinação com a entrega de reagentes citosólicos catiônicos .
Ao contrário de muitos tipos estruturais antisense, como fosforotioatos ou pequenos RNAs interferentes, os morfolinos não degradam as moléculas de RNA às quais se fixam. Os morfolinos agem por impedimento estérico ligando-se à sua sequência alvo em um RNA, eles atrapalham as moléculas que, na sua ausência, interagem com o RNA.
Os oligonucleotídeos morfolino são frequentemente usados para investigar o papel de um mRNA específico transcrito no embrião. Os biólogos do desenvolvimento injetam os oligonucleotídeos morfolino nos ovos ou embriões de peixe-zebra , xenopus , pintinho e ouriço-do-mar , produzindo assim embriões morfantes . Com um sistema de transferência citoplasmático apropriado, os morfolinos são usados de forma eficiente na cultura de células .
Os morfolinos são desenvolvidos como produtos farmacêuticos sob o nome " NeuGene " pela AVI BioPharma Inc. Eles têm sido usados em mamíferos que variam de camundongos a humanos e alguns são comumente testados em ensaios clínicos como terapia, anticâncer ou no tratamento da distrofia muscular de Duchenne.
Em organismos eucarióticos , o pré-mRNA é transcrito para o núcleo, os íntrons são processados e, em seguida, o mRNA maduro é exportado do núcleo para o citoplasma . Pequenas subunidades de ribossomo geralmente começam anexando-se a uma extremidade do mRNA e são unidas por vários fatores de iniciação , formando assim o complexo de iniciação. O complexo de iniciação viaja através da fita de mRNA até encontrar o códon de iniciação , ponto no qual a grande subunidade do ribossomo se liga à pequena subunidade. A tradução da proteína começa. Todo esse processo é conhecido como expressão gênica. É o processo pelo qual a informação de um gene , codificada pela sucessão de bases nitrogenadas no DNA, é convertida em uma estrutura proteica. Um morfolino pode modificar o splicing ou bloquear a tradução dependendo da sequência de bases do morfolino.
Ligados a uma região 5 'não traduzida de um RNA mensageiro (mRNA), os morfolinos podem interferir com a progressão do complexo de iniciação ribossomal da capa 5' para o códon de iniciação. Esta inativação da expressão gênica impede a tradução da região codificadora do transcrito direcionado. Isso é útil do ponto de vista experimental quando um pesquisador deseja saber a função de uma proteína específica. Os morfolinos fornecem uma maneira conveniente de inativar a expressão da proteína alvo e estudar como a inativação altera a célula ou organismo. Alguns morfolinos inativam a expressão de forma tão eficaz que, após a degradação de proteínas pré-existentes, as proteínas-alvo se tornam indetectáveis por eletrotransferência .
Os morfolinos podem interferir nos estágios de processamento do pré-mRNA , seja impedindo o acasalamento do pequeno complexo de ribonucleoproteína nuclear ( snRNP ) com seus alvos na borda dos íntrons na fita pré-mRNA ou bloqueando as adeninas nucleofílicas , evitando assim a formação de adeninas nucleofílicas . de emenda de estruturas de laço ou interferindo na fixação de proteínas de emenda regulatórias, como "silenciadores de emenda" e " intensificadores de emenda ". Prevenindo a ligação de U1 (no local doador) ou U2 / U5 (metade na polipirimidina e metade no local aceitador), os snRNPs podem causar alterações de splicing , comumente a exclusão de exons da maturação de .mRNA. O direcionamento de determinados alvos de emenda leva à exclusão do íntron , enquanto a ativação de locais de emenda ocultos pode levar a inclusões ou exclusões parciais. Os alvos dos complexos snRNPs U11 / U12 também podem ser bloqueados. A modificação do splicing pode ser validada pela reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa ( RT-PCR ) e se manifesta, em gel de eletroforese , pelo deslocamento da banda do produto RT-PCR.
Morfolinos têm sido usados para bloquear a atividade de microRNAs e para bloquear a atividade de ribozimas . As funções dos snRNPs U2 e U12 foram inibidas pelos morfolinos. Morfolinos direcionados a sequências de mRNA deslizantes em regiões de codificação podem induzir a mudança de quadro de leitura . As atividades dos morfolinos contra essa variedade de alvos sugerem que os morfolinos podem ser usados como ferramentas de uso geral para bloquear as interações de proteínas ou ácidos nucléicos com mRNAs.
Gene Tools, LLC e AVI BioPharma Inc. são empresas que reivindicam direitos de propriedade intelectual em vários aspectos dos oligonucleotídeos morfolino.