O Western blot (também conhecido como proteínas de transferência ou western blot ou técnica de immunoblots ), é um método de biologia molecular para a detecção e identificação de proteínas específicas em uma amostra biológica ( soro ou outro extrato ou tecido homogenado ) utilizando anticorpos direcionados contra essas proteínas que se deseja detectar. O western blot, portanto, torna possível visualizar proteínas específicas em uma mistura complexa. É uma das técnicas analíticas de transferência de membrana utilizadas em bioquímica e biologia molecular.
Às vezes, é usado como uma ferramenta de diagnóstico complementar para detectar uma proteína específica (por exemplo, proteína viral) no soro de um paciente.
Essa técnica, nascida dos avanços da proteômica , biologia molecular e imunofluorescência , utiliza a eletroforese em gel de poliacrilamida para separar proteínas, previamente desnaturadas , de acordo com seu tamanho.
Essas proteínas são então transferidas do gel para uma membrana (normalmente nitrocelulose ), onde são expostas a um anticorpo específico para a proteína de interesse. É possível graças a esta técnica detectar a presença de uma proteína em um tecido, avaliar seu tamanho, sua concentração, as variações desta concentração, realizar comparações de concentrações entre diferentes grupos, etc. Outras técnicas que utilizam anticorpos permitem a detecção da proteína nas células após a fixação ( imunocitoquímica ) e nos tecidos ( imunohistoquímica ).
O método foi desenvolvido no laboratório de George Stark em Stanford. O nome de western blot , dado à técnica por W. Neal Burnette, é um trocadilho com a técnica de Southern blot ou Southern blot , uma técnica de detecção de DNA que leva o nome de seu inventor, Edwin Southern e não de acordo com o ponto cardeal. A detecção de RNA é chamada de Northern blot ou Northern blot . Todas essas técnicas derivam seu nome da etapa de transferência da membrana, em comparação com uma impressão em um mata - borrão ( blot = "mancha" em inglês ).
Amostras (de tecido ou cultura de células) são rapidamente resfriadas ou mesmo refrigeradas (abaixo de 0 ° C ). São homogeneizados por sonicação (uso de ultrassom para romper as membranas), estresse mecânico ou simplesmente lisados por meio de tampões com alta concentração de sais. Isso resulta em um homogenato de todos os compartimentos celulares, que podem ser usados como tal ou ser submetidos a várias etapas de centrifugação diferencial para isolar as frações citosólica , nuclear e de membrana . A amostra é então processada para coletar um nível constante de proteína de cada amostra diferente. Isso envolve um ensaio de proteína pelo método de Biuret ou Coomassie blue ( método de Bradford ).
As amostras são então fervidas por 1 a 5 minutos em uma solução tampão de eletroforese (por exemplo, tampão de Laemmli), contendo uma substância tampão, geralmente Tris , um corante, um componente sulfidrila (normalmente beta-mercaptoetanol ou ditiotreitol ou mais simplesmente DTT ), uma substância lipofílica detergente aniônico ( dodecil sulfato de sódio ou SDS) e glicerol para reduzir o impulso de Arquimedes . O empurrão de Arquimedes implica, um corpo imerso em um fluido, verticalmente para cima.
A fervura desnatura as proteínas, quebrando ligações intramoleculares fracas, o que resulta no seu desenrolar completo. O SDS então fornece a eles um ambiente rico em cargas negativas para solvatá-los e evitar a precipitação, e o componente sulfidrila impede a regeneração das pontes dissulfeto . O glicerol aumenta a densidade da amostra em relação ao tampão no topo do reservatório de gel, facilitando a colocação de amostras que descerão mais facilmente para o fundo dos compartimentos de gel.
As proteínas da amostra são separadas de acordo com seu tamanho por eletroforese em gel , cuja composição varia de acordo com o laboratório, o peso molecular das proteínas de interesse e os tampões disponíveis. Os géis de poliacrilamida são os mais comuns . Como as proteínas só passam pelo gel em uma dimensão (de cima para baixo), as amostras são carregadas uma ao lado da outra em poços formados no gel. As proteínas são separadas por massa em "bandas" em cada "pista" formada sob os poços. Uma pista é reservada para um "marcador" ou "escala padrão", uma mistura de proteínas com pesos moleculares definidos disponíveis comercialmente.
Também é possível utilizar um gel 2D que, a partir de uma única amostra, permite a migração de proteínas em duas dimensões. As proteínas são então separadas por seu ponto isoelétrico (isto é, o pH em que sua carga líquida é neutra) na primeira dimensão e por seu peso na segunda.
A composição de um tampão de eletroforese ( tampão de corrida ) para western blotting é um volume de tampão TGS ( Tris - glicina - SDS ) diluído 10 vezes em 9 volumes de água destilada.
Para tornar as proteínas acessíveis para detecção por anticorpos, elas são transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF . A membrana é colocada face a face com o gel e uma corrente elétrica é aplicada às grandes placas em um dos dois lados. As proteínas carregadas migram do gel para a membrana retendo a organização relativa que tinham no gel. Como resultado dessa transferência, as proteínas são expostas em uma superfície fina, o que facilita as etapas de detecção subsequentes. Ambas as membranas de nitrocelulose e PVDF são "pegajosas", ligando proteínas de uma forma não específica (isto é, ligam todas as proteínas presentes na amostra da mesma forma). A ligação das proteínas à membrana ocorre por meio de interações hidrofóbicas e iônicas entre a membrana e as proteínas. Embora as membranas de nitrocelulose sejam mais baratas do que as membranas de PVDF, elas são menos fortes e não podem ser usadas várias vezes. Ao contrário das membranas de nitrocelulose, as membranas de PVDF devem ser embebidas em metanol 100% ou isopropanol antes do uso.
A composição de um litro de um tampão de transferência típico é:
Esta etapa visualiza a proteína total que foi transferida com sucesso para a membrana. A coloração de proteína permite ao usuário verificar a uniformidade da transferência de proteína e realizar a normalização subsequente da proteína alvo com a quantidade real de proteína por pista. A normalização com o chamado "controle interno" tem sido baseada na imunocoloração de proteínas constituintes ou proteínas estruturais (como actina ou tubulina ) no procedimento clássico, mas mudou para a coloração de proteína total recentemente, devido às múltiplas vantagens. Foram descritas pelo menos sete abordagens diferentes para a coloração de proteína total para padronização de Western blot: Ponceau S, técnica sem manchas , Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R-350, Amido Black e Cy5. A fim de evitar ruído de sinal, a coloração de proteína deve ser feita antes do bloqueio da membrana. No entanto, manchas pós-anticorpo também foram descritas.
Uma vez que a membrana foi escolhida por suas propriedades de ligação não específicas, uma vez que a proteína alvo e os anticorpos são proteínas, devem-se tomar precauções para minimizar as interações entre a membrana e o anticorpo. O bloqueio de locais de interações não específicas entre a membrana e os anticorpos é obtido pela imersão da membrana em uma solução diluída de proteínas - mais frequentemente albumina de soro bovino ou BSA (BSA) ou leite sem matéria. Gordurosos (leite diluído a 5% - 5 g por 100 ml) - na presença de detergente, tipicamente Tween 20), durante uma hora à temperatura ambiente.
As proteínas na solução diluída ligam-se à membrana em todos os locais não ocupados pela proteína alvo. Desta forma, quando os anticorpos são aplicados na próxima etapa, eles podem (idealmente) apenas se anexar à membrana nos locais de ligação da proteína alvo, o que reduz o "ruído de fundo". No Western blot final, o produto dá resultados mais claros e elimina falsos positivos .
Durante a detecção, a membrana é "sondada" para a proteína de interesse com anticorpos, então ligada a uma enzima que emite um sinal fotométrico ou colorimétrico , ou então fótons. Por vários motivos, isso geralmente ocorre em duas etapas, embora os métodos de uma etapa estejam disponíveis para alguns aplicativos.
Método de duas etapas Anticorpo primárioOs anticorpos são gerados inoculando o animal (geralmente um coelho ou uma cabra ) ou expondo uma cultura de células do sistema imunológico à proteína de interesse em sua totalidade ou apenas em uma de suas frações ( epítopo ). No entanto, uma vez que as proteínas foram desnaturadas durante a eletroforese em gel, devem ser usados anticorpos que reconheçam especificamente a proteína desnaturada, e não a proteína nativa.
A resposta imune normal é neste caso explorada a fim de gerar anticorpos que são colhidos e usados como ferramentas de detecção possuindo boa sensibilidade e boa especificidade, ligando-se diretamente à proteína - daí seu nome anticorpo. "Primário". Alguns anticorpos monoclonais , que são muito mais difíceis de produzir e cuja afinidade é muito maior, também podem ser usados em western blotting.
Após o bloqueio, uma solução diluída de anticorpo primário (geralmente entre 0,5 e 5 microgramas / ml) é incubada com a membrana com agitação moderada. A solução normalmente consiste em um tampão salino próximo a pH neutro (geralmente uma pequena quantidade de cloreto de sódio ), uma pequena porcentagem de detergente e, às vezes, proteína ( BSA ou leite a 5%) diluída. A solução de anticorpo e a membrana podem ser seladas em um saco plástico e incubadas juntas por 30 minutos até a noite. Ele também pode ser incubado em diferentes temperaturas, com temperaturas mais altas sendo associadas a ligações mais específicas.
Anticorpo SecundárioDepois de enxaguar a membrana para remover os anticorpos primários não ligados, ela é exposta a outro anticorpo, dirigido contra uma porção espécie-específica do anticorpo primário. Este anticorpo é conhecido como um anticorpo "secundário" e tende a ser referido, devido às suas propriedades de direcionamento, como "anti-camundongo", "anti-cabra", "anti-coelho", etc. Os anticorpos são de origem animal (mas geralmente de espécies diferentes das espécies do anticorpo primário) ou de culturas de hibridoma de origem animal; um anticorpo anti-camundongo se liga a virtualmente qualquer anticorpo primário de origem murina, economizando dinheiro ao permitir que o laboratório compartilhe uma única fonte de anticorpo secundário e permitindo resultados mais reproduzíveis. O anticorpo secundário está geralmente ligado à biotina ou a uma enzima que permite a identificação visual da proteína em estudo na membrana, como a fosfatase alcalina ou a peroxidase de rábano . Essa etapa confere uma vantagem, na medida em que vários anticorpos secundários se ligam a um anticorpo primário, possibilitando melhorar o sinal.
Mais comumente, um anticorpo secundário ligado à peroxidase de rábano (peroxidase de rábano) é usado em conjunto com um agente luminescente e o produto da reação emite luminescência proporcional à concentração de proteína. Um filme fotográfico sensível é colocado contra a membrana e, após a exposição à luz devido à reação, cria uma imagem dos anticorpos ligados à membrana. Mais frequentemente agora, uma câmera CCD é usada no lugar de filmes fotográficos.
Tal como acontece com os procedimentos ELISPOT e ELISA , a enzima pode ser fornecida com uma molécula de substrato que será convertida pela enzima para emitir um produto de reação colorido visível na membrana.
Uma terceira possibilidade é usar um marcador radioativo em vez de uma enzima acoplada ao anticorpo secundário, por exemplo, marcando uma proteína de ligação a anticorpos, como a proteína A de Staphylococcus com um isótopo radioativo de iodo . No entanto, sendo os outros métodos mais seguros, rápidos e baratos, este método caiu mais ou menos em desuso, mas às vezes ainda é usado em certas circunstâncias.
Método de uma etapaQuando a técnica apareceu pela primeira vez, o processo de detecção era realizado em duas etapas, devido à relativa facilidade de produção de anticorpos primários e secundários em dois processos distintos. Isso permite aos pesquisadores e fornecedores flexibilidade no uso e adiciona uma etapa de amplificação do sinal ao processo de detecção. No entanto, com o advento de análises de proteínas de alto rendimento com uma margem de detecção mais baixa, ou seja, detectando proteínas em concentrações muito baixas, tornou-se interessante desenvolver sistemas de sondagem de uma etapa, únicos que irão economizar tempo e economizar matéria-prima. Esses sistemas requerem um anticorpo de detecção capaz de detectar a proteína de interesse e emitir um sinal detectável, que muitas vezes estão disponíveis para marcadores de proteína conhecidos. A sonda primária é incubada com a membrana de forma semelhante ao anticorpo primário no método de duas etapas e, então, está pronta para detecção direta após uma série de etapas de enxágue.
Depois de enxaguar os anticorpos secundários não ligados, o western blot está pronto para a detecção das sondas marcadas e ligado à proteína de interesse. Na prática, nem todos os western blots revelam a proteína em uma determinada faixa da membrana, os géis não sendo completamente livres de proteína após serem transferidos. Uma aproximação do tamanho é feita comparando as bandas marcadas com aquelas dos marcadores de faixa padrão carregados durante a eletroforese em um poço separado. O processo é repetido para uma proteína estrutural, como a actina ou a tubulina , cuja concentração não deve variar entre as amostras (controle interno). A concentração da proteína-alvo é indexada à da proteína que serve de controle interno, a fim de padronizar os experimentos. Esta prática permite a correção em relação ao nível de proteína total na membrana, no caso de erro ou transferência incompleta.
Detecção colorimétricaEste método depende, durante a incubação do Western blot, da presença de um substrato que reaja ao gatilho presente no anticorpo secundário (como a fosfatase alcalina ). Isso converte um corante solúvel em uma forma insolúvel de cor diferente que precipita junto com a enzima, manchando assim a membrana de nitrocelulose. O desenvolvimento do western blot é então interrompido por lavagem do corante solúvel. A concentração de proteína é avaliada por densitometria , avaliação da intensidade da banda ou por espectrofotometria .
Detecção de quimioluminescênciaEste método requer, durante a incubação do western blot, a presença de um substrato que emita luz após a exposição ao gatilho presente no anticorpo secundário. A luz emitida é utilizada para imprimir um filme fotográfico, ou mais recentemente, por câmeras CCD que reproduzem uma imagem digital do transfer ocidental. A imagem é analisada por densitometria, que avalia a taxa relativa de marcação da proteína e quantifica os resultados em relação à densidade óptica . O software permite uma análise mais aprofundada dos dados, como a análise do peso molecular, caso sejam utilizados padrões apropriados. Este método denominado detecção de quimioluminescência aprimorada ( ECL quimioluminescente aprimorada ) é considerado um dos métodos de detecção mais sensíveis para a análise de Western blots.
Detecção de autoradiografiaA marcação radioativa não requer substrato enzimático, mas permite o uso de filmes usados na medicina para imagens de raios X. O filme é colocado diretamente na membrana, que se expande com a exposição ao marcador e cria regiões escuras, que correspondem às bandas da proteína de interesse ( cf. ilustração). A importância dos métodos de detecção de radioatividade está diminuindo, devido ao seu custo e técnicas mais seguras como o ECL.
Detecção de fluorescênciaA sonda acoplada ao anticorpo é excitada por um raio monocromático e a emissão resultante é então detectada por um fotossensor, por exemplo, uma câmera CCD equipada com os filtros de transmissão apropriados, que restaura uma imagem digital da transferência ocidental e permite uma análise mais precisa, como análise de peso molecular ou análise quantitativa de western blot. A fluorescência é considerada aproximadamente equivalente à quimioluminescência para a análise de western blots. No entanto, requer ferramentas mais caras.
Diferença entre fluorescência e quimioluminescênciaEmbora de mecanismo fotofísico semelhante, quimiluminescência e fluorescência não são a mesma coisa:
Uma das maiores diferenças entre essas membranas de nitrocelulose e PVDF está relacionada à sua capacidade de suportar o anticorpo "puxar" ( remover ) e reutilizar as membranas para pesquisas por outros anticorpos. Embora existam protocolos bem estabelecidos para reutilizar membranas de nitrocelulose, o PVDF mais espesso permite que essas manobras sejam realizadas com segurança e facilidade, e mais usos subsequentes antes de serem, como um palimpsesto , sinais espúrios revestidos. Outra diferença importante é que o PVDF, ao contrário da nitrocelulose, deve ser embebido em etanol 95% ou isopropanol antes do uso. As membranas de PVDF também tendem a ser mais espessas e resistentes a danos físicos decorrentes do uso normal.